Single-Cell DNA Sequencing Reveals Punctuated and Gradual Clonal Evolution in Hepatocellular Carcinoma

摘要 ：肝细胞癌（HCC）作为原发性肝癌的主要类型，约占其发病率的 80%，是全球癌症相关死亡的第三大诱因。目前，靶向治疗和免疫疗法在 HCC 治疗领域效果欠佳。目前对于 HCC 瘤内异质性（ITH）的研究大多停留在组织层面，然而，因基因组不稳定性引发的拷贝数改变（CNA）是 ITH 的关键来源。

本研究对 11 例 HCC 病例共计 1631 个细胞进行了单细胞 DNA 测序（scDNA-seq），并结合另外 3 例 HCC 病例中 27344 个细胞的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，创新性地提出了 HCC 中的双相拷贝数进化（DPCNE）模型，这一模型同样具有推广性，可适用于其他类型癌症。基于该模型，我们发现 CAD 基因（参与嘧啶合成的关键基因）与延长的渐进期、快速的肿瘤发生以及降低的存活率紧密相关。

单细胞 DNA 测序揭示肿瘤组织中的细胞亚群

研究团队对来自肿瘤组织的 1222 个细胞以及来自相邻非肿瘤肝（AL）组织的 53 个细胞进行了单细胞 DNA 测序（scDNA-seq），成功在肿瘤组织中鉴定了三个细胞亚群：

整倍体细胞

这类细胞未检测到任何拷贝数改变（CNA），其在肿瘤组织中的占比范围为 5.7% 至 66.5%。研究推测这些整倍体细胞主要为非实质细胞，包括内皮细胞和成纤维细胞等。

假整倍体细胞

部分具有整倍体拷贝数分布特征的细胞出现了 1 - 10 个拷贝数改变（CNA）。值得注意的是，在 9/10 的患者样本中均观察到了这一现象。

非整倍体细胞

这类细胞表现出显著的拷贝数改变（CNA）特征。

为了深入探究非整倍体细胞间的异质性，研究团队将重点聚焦于非整倍体细胞群体。研究发现，无论是同一患者还是不同患者，非整倍体细胞中每个细胞基因组发生改变的百分比（涵盖扩增和缺失情况）均存在较大差异。通过 tSNE（一种可视化降维技术）分析发现，同一患者的非整倍体细胞倾向于聚集于同一个细胞簇（cluster），而不同患者的非整倍体细胞则分别落入不同的细胞簇。

在 HCC 肿瘤高 ITH 的进化模型中，作者以 P9 为例进行分析。P9 共有 123 个细胞，涵盖 7 个整倍体、27 个假整倍体及 89 个非整倍体细胞。在 P9 的整个基因组 71 个区域中，共识别出 66 个 CNA。其中，假整倍体细胞含有 1 到 16 个 CNA，而非整倍体细胞则鉴定了 33 至 58 个 CNA。非整倍体细胞与假整倍体细胞共享的 CNA 百分比较高，这表明克隆多样性在早期阶段较大，随着肿瘤进展而减少，暗示存在潜在的克隆扩增。

为了定量评估 P9 中的进化模型，研究者对以下三种数学拟合方法进行了比较：GCNE 模型的线性拟合、PCNE 模型的一步拟合以及新型 DPCNE 模型的组合拟合。在评估过程中，研究者采用了四项指标：调整后的 R2、预测的 R2、贝叶斯信息准则和赤池信息准则（Akaike criterion）。结果显示，DPCNE 模型（调整后的 R2=0.9988，预测的 R2=0.9987）优于两个 GCNE 模型（调整后的 R2=0.9417，预测的 R2=0.9414，P<2.22×10−16）和 PCNE 模型（调整后的 R2=0.9848，预测的 R2=0.9846，P<2.22×10−16）。

为探究 DPCNE 模型是否适用于其他患者，作者为所有患者构建了系统发育树。结果显示，大多数患者的发育树呈现出短树干搭配长树枝的形态，这表明 CNA 的逐渐积累在整个肿瘤进化过程中占据主导地位。进一步分析这些患者的非整倍体细胞后发现，其 CNA 差异范围为 8 到 25，这一跨度显著高于 PCNE 模型中提出的 1 - 3，充分表明肿瘤细胞在肿瘤进展的晚期阶段仍在持续获得新的 CNA。

在对 P9、P6、P7 和 P8 的分析中，作者发现 DPCNE 拟合相较于其他两种拟合方法具有显著优势，这一现象与这四名患者所处的长期进化阶段相吻合，因此将这一组患者定义为 G 组。在剩下的患者中，DPCNE 拟合虽仍显示出相对于 PCNE 模型的优势，但优势幅度较小，这与患者相对较短的渐进进化阶段相符，此组患者被定义为 P 组。

进一步地，通过定量比较不同肿瘤之间的 PWD-CNA，研究团队观察到 G 组与 P 组肿瘤之间存在最显著的差异。将每组的 PWD-CNA 值进行汇总分析后发现，G 组的 PWD-CNA 明显高于 P 组。这表明基于模型拟合对 P 组和 G 组肿瘤的分类是稳健的。值得注意的是，具有渐进期的 G 组肿瘤展现出更高程度的瘤内异质性（ITH）。

鉴定 G 组的潜在驱动基因：CAD 的发现

为了挖掘 G 组中延长渐进阶段的潜在驱动基因，作者对 P 组和 G 组肿瘤之间的拷贝数变异（CNA）进行了全基因组层面的比较分析。在两个组共有的 CNA 中，包含了许多知名的驱动基因，如 TP53 和 AXIN1。此外，诸如 ARID2 的扩增以及 TSC1 和 WNK2 的缺失等 CNA 在 G 组中出现的频率更高。

基于 G 组肿瘤的两个显著特征——较短的无病生存期（DFS）和较高的瘤内异质性（ITH），作者精心设计了一种综合策略，用于筛选 G 组富集的 CNA 中的关键基因。首先，利用 17 名具有不同 DFS 的肝细胞癌（HCC）患者的大量 RNA 测序数据，将其分为早期复发组（7 例，DFS < 6 个月）和晚期复发组（10 例，DFS > 24 个月），共鉴定出 1146 个差异表达基因，其中早期复发组中有 613 个基因上调，533 个基因下调。接着，作者在 G 组中鉴定了 19 个扩增基因和 28 个缺失基因，这些基因的表达模式与上述大量 RNA 测序数据呈现出一致性。

随后，作者在目前已发表的最大规模 HCC 数据集（TCGA-LIHC）中，对 47 个候选基因与 ITH 之间的关联进行了评估。研究发现，CAD 基因作为一种新的候选基因，与 ITH 的程度呈现出最高的正相关性，其在 “ITH-高” 组中的表达量更高。CAD 基因编码氨甲酰磷酸合成酶 2、天冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酸脱氢酶（CAD）。最终确定 CAD 基因与较高的 ITH 和早期肿瘤复发密切相关。

先前的研究表明，CAD 参与了嘧啶合成过程，其上调能够加速癌症中的尿素循环代谢，进而通过支持合成代谢来促进肿瘤增殖。基于这些发现，血浆和尿液中与尿素循环相关的代谢物可作为 G 组患者、较高细胞 ITH 以及早期肿瘤复发的潜在生物标志物。