在分子生物学实验室中，Western Blot（WB）技术一直被视为蛋白质检测的“金标准”，但传统化学发光WB存在条带模糊、背景过高、信号不稳定、定量不准、多重检测困难……这些问题不仅影响实验结果的可靠性，更严重制约了研究效率。如今，新型荧光WB技术凭借高定量精度、多重检测能力、信号长期稳定等优势，成为科研工作者的得力助手。

（Martin et al., 2018）

01 技术原理

荧光WB技术是一种基于抗体特异性识别目的蛋白，利用荧光标记二抗进行检测蛋白表达的免疫印迹方法。首先，通过SDS-PAGE凝胶电泳，根据分子量大小将蛋白质分离，并将分离好的蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC膜）或聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）上；其次，基于抗体结合机制，先使用特异性识别目标蛋白的一抗与膜上目标蛋白结合，然后使用荧光标记二抗与一抗结合；最后，使用适当波长的激发光，通过荧光成像系统捕获荧光信号。荧光信号强度与目标蛋白的丰度呈线性关系，实现高精度定量。

02 技术流程

1、样本制备与定量：根据样本类型（细胞、组织、血清等）选择合适的裂解液（如RIPA裂解液），提取总蛋白并使用BCA法或Bradford法测定蛋白浓度；

2、SDS-PAGE电泳：根据目标蛋白分子量选择凝胶浓度，进行SDS-PAGE凝胶电泳，确保目标蛋白分离清晰；

3、蛋白质转移：将蛋白从SDS-PAGE胶上转移至NC膜或者PVDF膜，便于后续操作；

4、封闭与一抗孵育：使用5%脱脂奶粉或5% BSA溶液进行封闭，然后加入特异性一抗，置于4 ℃摇床上过夜孵育；

5、洗涤与二抗孵育：使用TBS洗去一抗，然后选择与一抗来源匹配的荧光标记二抗，室温摇床避光孵育1小时；

6、检测与图像分析：使用支持相应荧光染料的成像系统，根据具体染料选择合适的激发/发射波长观察并采集荧光信号用于后续分析。

03 技术对比

04 技术优势

（1）高定量精度：荧光信号静态且稳定，避免了化学发光信号随时间衰减导致的半定量问题；

（2）多重检测能力：通过选择激发/发射波长不同的荧光标记二抗，可在同一膜上同时检测多个目标蛋白；

（3）信号长期稳定：荧光信号可保存数周至数月，便于重复检测和分析；

（4）线性动态范围广：覆盖更广的蛋白浓度范围，减少重复上样；

（5）无需底物：化学发光需鲁米诺等底物，荧光直接通过光激发检测，简化操作；

（6）避免蛋白损失：多重检测无需剥离，减少因剥离不完全造成的蛋白损失。

05 文献案例

1、荧光Western blot助力开发新的TPD治疗策略

靶向蛋白降解（TPD）是一种新兴的治疗策略，通过药物小分子招募E3泛素连接酶介导靶蛋白降解。2024年，多伦多大学的Arrowsmith团队在线发表题为“Recruitment of FBXO22 for targeted degradation of NSD2”的研究文章，介绍了一种通过招募FBX022诱导组蛋白甲基转移酶和致癌基因NSD2降解的新的TPD策略。该文章借助荧光Western blot技术，阐明了新的强效NSD2降解剂UNC8732招募FBX022促进NSD2降解的分子机制，拓宽了TPD治疗策略。

（Nie et al., 2024.）

2、荧光Western blot同时检测t-LRRK2和p-LRRK2

Thirstrup等人借助荧光Western blot技术，在经PMA/IFN-γ处理的PBMCs细胞中（DMSO处理为对照）同时检测t-LRRK2和p-LRRK2(pSer935)的表达水平。结果显示，PMA/IFN-γ处理显著增加t-LRRK2表达，使用小分子LU AF58786处理则显著已知t-LRRK2的表达和磷酸化。

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参考文献

Martin KR, Celano SL, Solitro AR, et al. A Potent and Selective ULK1 Inhibitor Suppresses Autophagy and Sensitizes Cancer Cells to Nutrient Stress[J]. iScience, 2018. 8:74-84.

Nie DY, Tabor JR, Li J, et al. Recruitment of FBXO22 for targeted degradation of NSD2[J]. Nat Chem Biol, 2024. 20(12): 1597-1607.

Hirstrup K, Dächsel JC, Oppermann FS. et al. Selective LRRK2 kinase inhibition reduces phosphorylation of endogenous Rab10 and Rab12 in human peripheral mononuclear blood cells[J]. Sci Rep, 2017. 7(1): 10300.